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Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 10:26
von DerDerDasBierBraut
Hi,

einige von euch archivieren ihre Hefen eingefroren in Glycerol. Die Vorgehensweise, die ich damals dazu im alten Forum gefunden gefunden hatte, hat bei mir nicht funktioniert. 9 von 14 eingefrorenen Hefen sind tot. Die letzten 5 werfe ich jetzt ungetestet mit weg, um mir weiteren Frust zu ersparen.
Seit Stefans schöner Anleitung mit dem Hefebanking in isotonischer NaCl Lösung habe ich alle neu hinzugekommenen Hefen in Kochsalzlösung archiviert. Davon habe ich auch schon einige wiederverwendet und hatte bisher keine Ausfälle. Dieses System funktioniert also gut.

Mich interessiert, was damals mit dem Glycerol schief gelaufen ist und wie man es richtig macht. :Waa

Meine Vorgehensweise war:

Einlagern:
  • 40ml Petling mit Isopropanol desinfizieren
  • Ränder und Deckel des Petlings abflammen (Vorsicht beim Nachmachen, Flaschengeist kann entstehen!)
  • Petling halb mit Erntehefe füllen (etwa 18ml, abgeflammter Löffel)
  • etwa 2ml Hefenahrung zugeben (abgekochte schwache Würze)
  • etwa 18ml Glycerol zugeben
  • Petling verschließen, abflammen, beschriften
  • Petling im Kühlschrank herunterkühlen
  • Petling aufschütteln, damit sich Hefe und Glycerol noch einmal vermischen und ab in den Gefrierschrank
Aufwecken:
  • Petling vom Gefrierschrank in den Kühlschrank legen und langsam auftauen lassen
  • parallel 25 ml Starter im Kühlschrank abkühlen
  • Ränder und Deckel des Petlings abflammen
  • Hefe im Petling aufschütteln, 2-3ml Suspension entnehmen und in die Starterwürze geben
  • Petlingränder und -deckel abflammen, verschießen, zurück in die Truhe
  • Starter langsam auf Raumtemperatur bringen und auf den Magnetrührer stellen
Eine Hefe hatte ich damals auf diese Weise 1-2 Monate eingefroren und erfolgreich wiederverwendet. Daher war ich mich sicher, dass dieses System funktioniert. Beim Aufwecken vor ein paar Tagen war sie jetzt aber auch tot. :puzz

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 10:42
von haefner
Vielen Dank für das Thema. Genau das gleiche bei mir. Nach Methode des alten Forums eingefroren, meistens nur Tote Hefen. Hat mir einen Sud kaputt gemacht :-(. Habe mir nicht mehr getraut so was zu machen.

Dann werde ich mir sofort das Thema von Stefan durchlesen und die Lösung bestellen.

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 10:47
von Mjoelnir
Glycerin ist in den Konzentrationen nicht gut für Zellen, daher sollte so schnell wie möglich eingefroren werden und so schnell wie möglich aufgetaut und dann direkt verdünnt werden. Könnte durchaus daran liegen. Bei uns im Labor kommen die Zellen nach dem Mischen mit Glycerin direkt in den -80iger und werden nach dem Auftauen sofort mit VE-Wasser oder Medium verdünnt.

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 11:23
von tbln
Ein paar Punkte, die ich mir noch notiert hatte und hilfreich seien könnten:
- möglichst vitale Hefe einfrieren
- keinen Tiefkühlschrank mit Abtauautomatik nutzen, da Temperaturschwankungen Zellwände zunehmend schädigen
- mehrmaliges Auftauen und Einfrieren vermeiden, siehe Punkt 2
- richtige Menge Glycerin. Diverse Quellen sprechen von ca. 10-20% am Gesamtvolumen: "Yeast" von Chris White und Jamil Zainasheff, http://bootlegbiology.com & suigenerisbrewing; eurekabrewing allerdings auch von 40%

Ich hab das erste mal vor einigen Monaten eingefroren. Werd zu gegebener Zeit berichten, ob sich was tut im Starter.

Kurze Anschlussfrage: Es wird bei allen genannten Quellen empfohlen, die Glycerinlösung im Autoklav zu sterilisieren. Kann evtl. jemand sagen, ob eine Verwendung von 0,2 µm Injektionsfiltern als Alternative Sinn macht?

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 12:11
von jemo
Im Prinzip mache ich das so wie oben beschrieben, der Glycerinanteil liegt dabei bei ca. 30%. Allerdings taue ich nicht langsam ab, sondern gebe den Inhalt des Petlings sofort in 200ml Starterwürze. Bis zum Gärstart dauert das dann ca. zwei Tage.
Das klappt problemlos, selbst Hefen die ich seit mehr als zwei Jahren eingefroren habe, lassen sich so wieder aufwecken.

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 13:28
von birrero
Ich nutze Glycerin 20% und die Drucktopf es zu sterilizieren. Ich nutze auch den Topf um die Petri schälchen und die Agar mit Würze zu sterilisieren. Ich lasse es im Gefrierfach von meinem normalen kühlschran. Nach einem Jahr war die Hefe noch gut. Aber das ist für mich zu viel arbeit, ein Liter Starter von ein paar Cellen zu machen... außerdem habe ich kein Microscopen, um das zu kontrollieren. Ich habe es ein paar mal gemacht, weil ich in Argentinien war nicht zu einfach neue Hefe Sorten zu bekommen. Hier ist es einfacher und ich kaufe einfach die 10gr Tasche für meinen 20ltr Süd.

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Freitag 8. Dezember 2017, 14:09
von muldengold
Ich kann das Microbank System empfehlen, gibt's von verschiedenen Herstellern. Hier z.B. aus der Bucht für 80$ für 80 Vials:

https://www.ebay.de/itm/Pro-Lab-Diagnos ... AOSw-09aDb~~

Benötigt werden noch Impfösen (gibt's aus Kunststoff als Einmalartikel) und eine Pipette - Einmal-Pasteur-Pipetten sollten auch funktionieren.

Prinzip: im Röhrchen sind mehrere (etwa 20) Keramik-Kügelchen in einer Frostschutzlösung ("crypreservative solution") enthalten -> Hefekolonie von Nährbodenplatte (evtl. geht auch Hefesediment? - ich würde sagen ja) in Röhrchen geben, und vorsichtig mischen. Die Hefezellen adherieren an den Kügelchen. Flüssigkeit abziehen und ab in den Frost. Zum Aufpäppeln einfach Röhrchen aus dem Frost holen ein Kügelchen möglichst steril entnehmen und in ein wenig Würze (z.B. 2 ml) fallen lassen. Auf Wachstum warten und dann schrittweise hochpäppeln. Das System ist für -70°C ausgelegt, sollte aber auch bei -20°C gute Ergebnisse erzielen. Der Vorteil ist: durch die Entname eines Kügelchens muss ich den Rest der Kügelchen nicht auftauen. Wenn die Flüssigkeit (s.o.) vollständig abgezogen wurde liegen die Kügelchen mehr oder weniger locker im Röhrchen und sind nicht in einem großen "Frostklumpen" vereint.

Sandro

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 25. Oktober 2018, 07:36
von Sura
Moin,

Ich hab hier noch einen Beutel frische Hefe von WYeast. Da der langsam aus der "guten Zeit" läuft, wollte ich mal ausprobieren wie das mit einfrieren geht. Die Theorie ist soweit (hoffentlich) klar: Ungefähr die dreifache Lösung Menge an 30%Glycerol Lösung bereiten wie ich Hefebrei habe, diese dann auf die selbe Temperatur wie die Hefe kühlen, den Hefebrei rein, durchschütteln, und einfrieren.

Bei Erntehefe ist das ja meistens klar beschrieben, aber selten für einen frischen Beutel. Wenn ich mir meinen WYEAST Pack anschaue, dann sollen da 125ml Hefebrei drin sein. Eine WLP-Tupe hat nur 40ml. Beide sollen ja ungefähr die selbe Zahl an Hefezellen haben. Ich würde jetzt davon ausgehen, das die Differenz zum Beutel von WYeast lediglich aus Wasser besteht.

Den Beutel von WLP würde ich in 120ml Glycerin-Gemisch geben und einfrieren.
Beim WYeast Beutel würde ich einfach nur Glycerin direkt dazu geben (dann komme ich auf den selben Stand).

Einen Zwischenstarter möchte ich vermeiden, wenns geht.

Gruß,
Kai

edit:
Ist wohl schlecht formuliert: Ich hatte das als Frage gemeint, ob das so ok ist :)

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 25. Oktober 2018, 08:08
von bierfaristo
Nicht 100%ig zum Thema.
Wenn tatsächlich „schnelles“ Abkühlen ein Schlüssel zum Erfolg ist, dann kann man ein ausreichend großes Gefäß mit gesättigter Kochsalzlösung in den Gefrierschrank stellen und auf -18°C kühlen. Die Lösung bleibt bei dieser Temperatur flüssig. Dann den beimpften PETling in die Lösung geben. Der Abkühlvorgang sollte dann deutlich schneller gehen. Theoretisch sollte man darin auch lagern können um Temperaturschwankungen auszugleichen.
Blanke Theorie, noch nicht in diesem Kontext versucht.

Christian

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 25. Oktober 2018, 09:11
von DerDerDasBierBraut
Passt auch nicht ganz zum Glycerol, aber wo der Thread schon mal wieder oben ist, ... :Wink
muldengold hat geschrieben: Freitag 8. Dezember 2017, 14:09 Ich kann das Microbank System empfehlen, gibt's von verschiedenen Herstellern. Hier z.B. aus der Bucht für 80$ für 80 Vials:

https://www.ebay.de/itm/Pro-Lab-Diagnos ... AOSw-09aDb~~
(Keine Werbung, keine Absprachen oder Provisionen, nur für euch zur Info und für mich als "Spickzettel")

Die spottbillige Microbank aus der Bucht gibt es leider nicht mehr und der Verkäufer dahinter (scheinbar eine Art Werkzeug- und Trödelladen) reagiert nicht auf Anfragen zur Wiedereinstellung des Artikels. Die Quelle ist also versiecht ... :Angry

In Deutschland wären die nächsten beiden Bezugsquellen mit halbwegs fairen Preisen:
[*] Cryobank® (sieht exakt genauso aus, wie die Microbank), 80 Vials mit je 25 Perlen
- Preis inkl. Versand 161,84 EUR
- https://www.aurosan-shop.de/de/mikrobio ... hen-md9105

[*] VIABANK, 80 Vials mit je 25 Perlen
- gibt es in zwei Varianten: Standard und "Yeast and Molds"
- bei der "Standard" entsprechen die Perlen in Größe und Oberflächenbeschaffenheit der Microbank bzw. Cryobank
- bei der "Yeast and Molds" sind die Perlen größer und stärker strukturiert, damit Hefezellen besser (und zahlreicher) anhaften können
- die Box ist leider aus Pappe, sodass man ggf. irgendwann eine Kunststoffbox wir 3-10 EUR in der Bucht nachkaufen muss
- Preis inkl. Versand 161,25 EUR (für die "Yeast & Molds") und 136,26 EUR für die "Standard"
- https://doenitz.de/products.php?term=vi ... 0&what=Bez

In UK gibt es noch einen Laborausstatter (bioconnections.net), der die gleiche VIABANK zu absoluten Schleuderpreisen verkauft.
Die Standard für 58,02 GBP und die Yeast&Molds für 94,34 GBP (jeweils zzgl. 20% VAT und 21,55 GBP Versand nach DE).
Wegen der hohen Versandkosten schmilzt der Preisvorteil von UK etwas ab, aber das könnten wir ziemlich sicher durch eine Sammelbestellung gut kompensieren. Ich wäre dabei, weil ich alle Stämme redundant bei der Verwandtschaft einlagern will (Stromausfall, Truhe kaputt etc.)

Alternative und günstige Kunststoffboxen zum Ersetzen der "VIABANK Pappe" habe ich hier gefunden: http://kryobox.de/shpSR.php?A=10143

Wer weitere, preislich interessante, Quellen findet - Bitte hier mitteilen ... :-)

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 25. Oktober 2018, 16:49
von flying
Vielleicht solltest Du mit Trehalose experimentieren? Das ist der Wunderstoff der Natur bei Einfrieren und Trocknen. Die vielen neuen, hochviabilen Trockenhefen sind überhaupt erst entstanden nachdem man sich über Funktion der Trehalose in der Zelle klar wurde. Die Trehalose bildet eine Schutzmatrix um die inneren Zellbestandteile.

Hefe wird bei Stress unter Anwesenheit von Glucose dazu angeregt Trehalose zu bilden. Eine Überlebensstrategie der Evolution. Vielleicht solltest Du die Hefe in einer 10%igen Trehaloselösung angären lassen, damit die Zelle den Stoff direkt aufnimmt. Dann unter sanfter Kühlung und Rühren das Frostschutzmittel beigeben. Möglichste homogen einfrieren..?

m.f.g
René

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Mittwoch 10. April 2024, 19:03
von Gimbel
Hallo Braugemeide,
gibt es schon neue Erkenntnisse zu Glycerol und Hefe ?
Der letzte Beitrag war von 25.10.2018.
Hat jemand neue Erfahrung ?

Bierige Grüße


Gimbel :Drink

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 11. April 2024, 09:27
von Andlix
bierfaristo hat geschrieben: Donnerstag 25. Oktober 2018, 08:08 Wenn tatsächlich „schnelles“ Abkühlen ein Schlüssel zum Erfolg ist, dann kann man ein ausreichend großes Gefäß mit gesättigter Kochsalzlösung in den Gefrierschrank stellen und auf -18°C kühlen. Die Lösung bleibt bei dieser Temperatur flüssig. Dann den beimpften PETling in die Lösung geben. Der Abkühlvorgang sollte dann deutlich schneller gehen. Theoretisch sollte man darin auch lagern können um Temperaturschwankungen auszugleichen.
Blanke Theorie, noch nicht in diesem Kontext versucht.
Es wird empfohlen die Röhrchen in Alkohol zu lagern, aber vor allem um Temperaturschwankungen auszugleichen.
Dann sollte man aber auch einen Alkoholfesten Stift für die Beschriftung nehmen (zum Glück hab ich zu Beginn nur eine Hefe eingelagert).

Ich hab jetzt schon Hefe die über 2 Jahre alt ist in der Gefriertruhe, die ohne Probleme wieder startet.
Das angenehme ist auch, dass man wieder Recht schnell auf die notwendige Hefemenge kommt.
Allerdings braucht das auch mehr Platz wie das Lagern in NaCl.

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 11. April 2024, 12:43
von Commander8x
Gimbel hat geschrieben: Mittwoch 10. April 2024, 19:03 Hallo Braugemeide,
gibt es schon neue Erkenntnisse zu Glycerol und Hefe ?
Der letzte Beitrag war von 25.10.2018.
Hat jemand neue Erfahrung ?
Was möchtest du denn wissen?

Gruß Matthias

Re: Hefebanking mit Glycerol - Wie gehts richtig?

Verfasst: Donnerstag 11. April 2024, 13:59
von Innuendo
Hallo,
ich gehe so vor:

1) 1 Teil Glycerin 99% lebensmitteltauglich + 2 Teile dest. Wasser mischen und vorkühlen
2) Hefe vorkühlen
3) Hefe und Glycerinmischung zu gleichen Teilen in ein geeignetes Gefäß geben und durchmischen

Das Vorgehen funktioniert, wenn die obigen Hinweise zum Abkühlen und Auftauen beachtet werden, mit Mengen ähnlich der Einlagerung auf NaCl bspw. in Pettlingen. Beim Einfrieren habe ich bspw. die Suspension immer wieder geschüttelt/durchmischt. Ein 15 Monate alter Pettling mit einer W34/70 habe ich im Februar für einen Test aufgetaut. Der Starter hat sich "wie immer" verhalten.

Ein Versuch in einem Eiskugelbeutel als "Lagergefäß" für die Hefe-Glycerin-Suspension war nicht erfolgreich.

Größere Mengen (Anstellmengen) konnte ich bislang nur erfolgreich totfrieren. Verwendet habe ich dafür Gefäße von Braupartner, in denen die ihre Flüssighefe (500ml) ausliefern.
Innu